胆汁淤积症（CT）是以胆汁流量显著减少为典型特征的临床现象，在肝胆系统的诊疗实践中构成了亟待解决的重大难题。有研究表明焦亡在肝损伤过程中扮演着至关重要的角色，这些研究不仅突出了NLRP3受体在胆汁淤积诱发的炎症调控中的核心地位，还进一步将焦亡与炎症反应之间建立了紧密的分子联系。与此同时，一系列并行展开的研究亦有力地论证了焦亡在CT病情进展中的决定性作用。

芍药苷（PF），作为一种源自芍药属植物的生物活性天然化合物，已在多种肝脏疾病的治疗中展现出显著的保肝效果。研究表明，PF不仅在治疗对乙酰氨基酚诱导的肝损伤方面展现出治疗优势，还具备调节胆汁酸代谢的潜力。现有研究进一步揭示，PF不仅能够促进胆汁酸的分泌，还显著增强了胆汁酸的运输与代谢过程。然而，关于PF是否通过精确靶向NLRP3/GSDMD信号通路来实现其保肝与利胆的双重作用，以及具体的治疗靶点尚待明确。

近日，一篇题为“Paeoniflorin inhibited GSDMD to alleviate ANIT-induced cholestasis via pyroptosis signaling pathway”的研究论文，深入探讨了PF对ANIT诱导的CT的缓解作用。该研究在揭示PF治疗潜力的同时，也为CT的治疗提供了新的视角和策略。
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图1 论文首页

PF改善了ANIT诱导的CT模型中的肝损伤

该研究成功构建了基于ANIT诱导的CT大鼠模型，并在此基础上进行了深入研究（图2A）。结果显示，PF能够显著降低由ANIT诱导的ALT、AST水平升高，有效缓解肝损伤症状。同时，PF还显著降低了BA、TBIL和DBIL水平，以及ALP和γ-GT水平（图2B-H），进一步证明了PF在减轻CT诱导的肝损伤方面的有效性。

此外，通过组织学观察发现，PF治疗组的大鼠肝脏中炎症细胞浸润程度及胆管增生程度均明显减少（图2I），表明PF在改善肝脏炎症和胆管增生方面也具有积极作用。同时，体外实验结果显示，PF能够显著提高ANIT处理的HepG2细胞的活力（图2K-L），但CCK-8检测表明，PF浓度为30 μM或更低的浓度在体外48小时内对细胞活力没有显著影响（图2J）。进一步支持了PF在保护肝细胞免受损伤方面的潜力。

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图2 PF改善了ANIT诱导的CT模型肝损伤

PF可能通过NLRP3通路改善ANIT诱导的焦亡

先前的研究已确凿地证明，芍药能够经由NF-κB/NLRP3信号通路有效减轻ANIT所诱导的CT。作为主要活性成分的PF，在缓解CT方面展现出显著的治疗潜质。该研究通过绘制维恩图，并构建了构建了药物靶-疾病关系网络(图3A-B)，确定了CT的靶点。为了阐明这些关键靶点在PF的CT治疗作用中的生物学功能，研究还进行了GO和KEGG通路富集分析（图3D-E）。结果显示，PF可能通过调控NLRP3介导的细胞焦亡途径，进而减少ANIT诱发的CT（图3F-J）。网络药理学分析揭示了高评分值的靶标中，NLRP3占据了核心位置。且对关键靶点的GO和KEGG通路富集分析，均强烈指向PF通过调整NLRP3依赖性的细胞焦亡机制来改善CT（图3）。
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图3 PF通过NLRP3途径改善ANIT诱导的焦亡

PF介导NLRP3/GSDMD通路改善ANIT诱导的焦亡

研究明确指出，PF可能经由NLRP3所介导的经典焦亡路径，有效缓解由ANIT所诱导的CT。为了更深入地探究焦亡机制，研究采用了电子显微镜这一精密工具进行观测，结果揭示，经PF处理的实验组中，线粒体肿胀现象显著减少（图4A）。同时，PF治疗还显著减轻了模型组中观察到的细胞肿胀状况，细胞膜上原本明显的孔洞以及众多的水泡状突起均有所缓解（图4K）。

进一步地，通过Western Blot（WB）实验，该研究发现在体内外实验中，与对照组相比，模型组的NLRP3、GSDMD-N、ASC、Caspase 1 P20等关键蛋白的表达水平均呈现明显上调趋势（图4B-P）。而PF的介入则显著逆转了这一现象，具体表现为上述蛋白表达水平的下调（图4G-Q）。免疫组化分析显示，模型组的融合区GSDMD阳性表达程度高于对照组，而PF处理显著降低了GSDMD阳性表达的面积（图4J）。这一发现为PF在缓解ANIT诱导CT过程中的作用机制提供了有力的实验证据。

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图4 PF介导NLRP3/GSDMD通路改善ANIT诱导的焦亡

PF通过靶向GSDMD改善ANIT诱导的焦亡

随后，该研究深入探讨了PF对ANIT诱导细胞焦亡的分子抑制机制，运用蛋白芯片技术以精确筛选PF的直接作用靶标（图5A-B）。结果显示，PF与GSDMD展现出显著的亲和力（图5C），这一发现暗示了PF可能通过直接结合GSDMD蛋白来抑制焦亡过程。为进一步验证此假设，该研究实施了一系列包括分子对接、CETSA以及SPR等科学实验（图5D-F），结果一致证实了PF与GSDMD之间存在直接的相互作用，可能会抑制焦亡。
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图5 PF通过靶向GSDMD改善ANIT诱导的焦亡

PF通过GSDMD抑制炎症因子的释放

在焦亡信号传导路径中，细胞往往会累积大量的pro-IL-1β和pro-IL-18。为了将这些促炎因子转化为活性形式，caspase-1的激活是不可或缺的。此外，caspase-1还负责裂解GSDMD，进而引发膜孔的形成。GSDMD的激活及其随后导致的膜孔形成，加速了裂解后的活性炎症因子的迅速释放，从而触发局部或全身性的炎症反应。

为了定量pro-IL-1β、pro-IL-18、IL-1β和IL-18的表达，研究对大鼠血清、大鼠肝组织和细胞上清进行检测。结果显示，与对照组相比，模型组中炎症因子的表达显著增加（P<0.01）。然而，体内和体外实验均显示，高剂量PF组（PF-H和10 μM）的pro-IL-1β、pro-IL-18、IL-1β和IL-18均显著下调（P<0.01）（图6A-D）。LDH水平的升高是焦亡现象的一个常见生物标志物，研究进一步发现模型组大鼠的血清和肝组织中LDH释放量显著增加，而PF治疗则显著逆转了这一趋势（图6E-F）。综上所述，这些结果暗示PF可能通过作用于GSDMD，从而减轻ANIT诱导的焦亡过程，并进而抑制下游炎症因子的释放（图6G）。

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图6 PF通过GSDMD抑制炎症因子的释放

结论

总之，PF给药被证实能有效减轻由ANIT诱导的肝脏病理损害，显著增强肝功能标志物的水平，并提升细胞活力。基于网络药理学的研究以及焦亡抑制剂的深入探索，PF可能通过调控NLRP3依赖性的焦亡途径，从而实现对CT的缓解作用。



参考文献：

Ma X, Zhang W, Chen Y, Hu Q, Wang Z, Jiang T, Zeng Y, Efferth T. Paeoniflorin inhibited GSDMD to alleviate ANIT-induced cholestasis via pyroptosis signaling pathway. Phytomedicine. 2024 Nov;134:156021. doi: 10.1016/j.phymed.2024.156021


作者｜梅斯医学
编辑 | 竹子
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