缺血性卒中（IS）是一种最为常见的卒中类型，其发病率占所有卒中类型的85%，具有高致死率和致残率的特点。目前，针对IS后神经损伤，尚缺乏安全有效的治疗药物。神经炎症反应被认为是IS的主要病理机制之一，因此，减轻炎症反应成为治疗该病的关键策略。

 

研究揭示，青蒿素（ART）具有抗细胞凋亡及心血管保护等多重生物学效应，其作用机制涉及激活ERK1/2/CREB/bcl2信号传导通路，从而减轻由IS引发的细胞凋亡。此外，研究结果亦显示，ART能显著降低细胞凋亡的分子标志物、氧化应激和神经炎症水平。ART是黄花蒿中的主要活性成分，作为一种脂溶性化合物，它能够穿越血脑屏障，进入大脑组织。

日前，一篇名为“Artemisinin attenuated ischemic stroke induced pyroptosis by inhibiting ROS/TXNIP/NLRP3/Caspase-1 signaling pathway”的文章探究了ART对IS诱导的细胞焦亡的抑制作用。

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图1 论文首页

ART减轻OGD/R引起的PC12细胞活力丧失

该研究通过MTT法评估了ART对神经元氧-糖剥夺再灌注（OGD/R）模型的细胞毒性影响。结果表明，PC12细胞在经历不同时间的OGD处理后，其细胞活力呈现出与时间相关的下降趋势（图2）。当OGD处理持续4小时时，PC12细胞的存活率显著降低约40%，基于此，研究选择OGD 4小时作为模型建立的时间点，进一步研究了ART对PC12细胞的保护效果。实验中，细胞首先被11至100μM浓度范围内的ART或0.1% DMSO预处理2小时，随后进行OGD处理4小时并复氧12小时，之后采用MTT法测定细胞存活率。结果显示，与对照组相比，OGD/R处理组的细胞活力显著降低。而ART在10μM浓度下对OGD/R诱导的细胞死亡显示出显著的保护作用（图2C）。

 

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图2 ART减轻OGD/R诱导的PC12细胞损伤

ART减轻PC12细胞中ROS的产生和Δψm的降低

基于ART对受损细胞的保护作用，该研究进一步探究了ART的保护机制是否与线粒体紧密相关。为此，研究者对ROS的生成以及线粒体膜电位的变动进行了测定。结果显示，OGD/R处理导致PC12细胞内ROS水平显著上升（图2D），同时线粒体膜电位下降（图2F）。然而，10μM的ART预处理能够有效抑制由OGD/R引起的ROS过度产生和线粒体膜电位（Δψm）的降低。

 

ART减轻OGD/R诱导的PC12细胞焦亡

线粒体ROS的异常累积能够触发NLRP3炎症小体的激活，进而导致细胞焦亡，加剧神经细胞的损伤。研究显示，ART具备抑制IS后线粒体损伤及ROS过度产生的能力。为探究ART是否能够减轻细胞焦亡，研究对不同实验组的细胞进行了Hoechst 33342染色、Annexin V-FITC/PI染色以及TUNEL染色检测。Hoechst 33342染料能够穿透细胞膜，而PI则不能，因此正常细胞和凋亡细胞不会被PI染色，但细胞焦亡时细胞膜完整性丧失，PI能够进入细胞并进行染色。
Hoechst 33342染色结果表明，OGD/R处理加剧了细胞焦亡和细胞核固缩现象，然在使用10μM ART或10μM MCC950预处理2小时后，细胞焦亡和核固缩现象显著减少（图3A、B）。Annexin V-FITC/PI染色及TUNEL染色的结果与Hoechst 33342染色结果相一致，表明OGD/R处理组的细胞焦亡率显著高于对照组。10μM ART或10μM MCC950预处理对OGD/R诱导的细胞焦亡具有显著的保护作用，细胞焦亡率明显降低（图3C-E）。

 

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图3 ART减轻OGD/R诱导的PC12细胞焦亡

ART对OGD/R诱导的PC12细胞炎症因子及细胞焦亡相关蛋白的影响

NLRP3炎症小体的激活促进了细胞焦亡途径，并进一步促进了IL-1β和IL-18的成熟，导致炎症因子的释放，从而加剧了炎症反应。为了评估ART预处理对细胞炎症损伤的保护效果，研究利用ELISA试剂盒对炎症因子IL-1β和IL-18的含量进行了测定。结果显示，与对照组相比，OGD/R组的IL-1β和IL-18含量显著上升；然而，在ART或MCC950预处理后，这两种炎症因子的含量显著下降（图4A-B）。此外，研究采用western blot技术检测了ART预处理对细胞焦亡相关蛋白表达的影响。结果如预期所示，10 μM ART或MCC950预处理显著降低了关键蛋白NLRP3、ASC-1、Caspase-1和TXNIP的表达水平（图4C-G）。

 

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图4 ART对OGD/R诱导的PC12细胞炎性因子及细胞焦亡相关蛋白的影响

ART改善光化学诱发血导模型小鼠运动功能及脑神经元损伤

该研究采用网格实验和圆筒实验，评估了ART对PIT小鼠神经损伤的保护效果。实验分别在模型建立前一日及后一日对小鼠进行了测试。网格实验结果（图5A）表明，与Sham组相比，Stroke组小鼠前肢步态异常的次数显著增加，而经过ART或MCC950预处理后，该现象得到了显著改善。圆筒实验结果（图5B）亦显示，与Sham组相比，Stroke组小鼠患侧肢体的使用频率显著降低，但经过ART或MCC950预处理后，此情况得到了一定程度的缓解。

此外，HE染色结果显示，Sham组的脑片显示出紧密的排列和清晰的细胞结构，而Stroke组的脑片则表现出细胞皱缩、组织间隙增大以及排列的紊乱。相较于Stroke组，Stroke+ART组和Stroke+MCC950组的脑组织排列紊乱、细胞皱缩和组织间隙扩大的情况有所缓解（图5C）。尼氏染色结果揭示，与Sham组相比，Stroke组、Stroke+ART组和Stroke+MCC950组的小鼠脑组织中尼氏体比例显著下降。然而，与Stroke组相比，Stroke+ART组和Stroke+MCC950组的小鼠脑组织中尼氏体比例有所增加（图5D）。

 

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图5 ART改善光化学诱发血栓模型小鼠运动功能及脑神经元损伤

ART对光化学诱导血栓模型小鼠炎症因子及细胞焦亡相关蛋白的影响

为评估ART预处理对PIT模型小鼠炎症性损伤的保护效应，研究运用ELISA试剂盒对炎症介质IL-1β及IL-18的含量进行了测定。结果显示，与Sham组相比，Stroke组的IL-1β及IL-18含量显著增加。然而，在ART或MCC950预处理后，这两种炎症介质的含量均显著下降（图6A-B）。此外，通过Western blot技术评估了ART预处理对PIT小鼠细胞焦亡相关蛋白表达的影响，结果表明，ART或MCC950预处理均能降低关键蛋白NLRP3、ASC-1、Caspase-1、TXNIP的表达水平（图6C-G）。

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图6 ART对光化学诱导血栓模型小鼠炎症因子及细胞焦亡相关蛋白的影响

 

结论
研究证实，ART能够通过抑制ROS/TXNIP/NLRP3/Caspase-1信号通路，降低IS引发的神经元焦亡现象，从而进一步确认了ART对卒中的保护效果。该发现表明ART有潜力成为预防和治疗IS的创新性神经保护药物。

 

参考文献：

Wang Y, Yuan H, Shen D, Liu S, Kong W, Zheng K, Yang J, Ge L. Artemisinin attenuated ischemic stroke induced pyroptosis by inhibiting ROS/TXNIP/NLRP3/Caspase-1 signaling pathway. Biomed Pharmacother. 2024 Aug;177:116894. doi: 10.1016/j.biopha.2024.116894

 

作者｜梅斯医学
编辑 | 竹子