针对炎症靶点开发治疗自免的PROTAC

诸多研究正在将与自免相关的炎症靶点和PROTAC两者相结合，比较热门的靶点是HDAC VI、IRAK3/4、PCAF、GCN5、JAK/STAT、RIPK2、STING、MIF、IKZF，针对这些靶点设计开发用于自免治疗的PROTACs，在临床前阶段显示出良好的体外效力。

引言：

PROTAC（Proteolysis Targeting Chimeras，蛋白降解靶向嵌合体）是一种创新的蛋白质降解技术，其结构由三部分组成：一端是与目标蛋白（POI）结合的配体，另一端是与特定的E3泛素连接酶结合的配体，中间通过一个Linker（连接子）相连。这种设计使得PROTAC分子能够同时结合目标蛋白和E3泛素连接酶，从而促进目标蛋白的泛素化，并通过泛素-蛋白酶体途径（UPS）实现目标蛋白的选择性降解。

通过设计特定的PROTAC分子，可以诱导与自身免疫性疾病相关的靶蛋白降解，从而为治疗这些疾病提供新的策略。在设计和评估PROTAC分子时，研究人员会关注其诱导靶蛋白降解的能力，这通常通过DC₅₀（半最大降解浓度）和Dmax来量化。DC₅₀是指能够导致目标蛋白降解50%的PROTAC浓度，而Dmax则表示在饱和浓度下PROTAC能实现的最大降解水平。现将HDAC VI、IRAK3/4、PCAF、GCN5、JAK/STAT、RIPK2、STING、MIF、IKZF靶点的临床前PROTACs开发情况介绍如下：

HDAC VI是目前与自身免疫性疾病关联最大的HDAC家族成员，负责炎症的调节，阻断HDAC VI可治疗类风湿性关节炎，以改善滑膜炎症。以下是针对HDAC V1靶点的PROTAC开发情况：

Compound2：Cao等人引入了“点击”化学的概念，合成了由不同连接子长度组成的PROTAC分子。其中化合物2的体外研究显示，DC₅₀为108.9 nM，能够显著降解HDAC VI，以及减少 IL-1β（白细胞介素-1β）的释放和p20（caspase-1的中间体片段）的产生；体内研究表明，化合物2降低IL-1β水平，而不影响TNF- α（肿瘤坏死因子-α）水平。

Compound3：Yang等人合成的PROTAC分子，以来那度胺作为配体与CRBN（E3连接酶配体）结合，DC₅₀为1.9 nM，显著降解HDAC VI。

 图3 靶向HDAC VI的PROTACs

IRAK（Interleukin-1 receptor-associated kinase）是与IL-1R和Toll样受体（TLR）信号传导相关的一类丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。IRAK家族成员通过激活下游的信号转导分子如NF-κB和MAPK途径，在调节炎症反应和免疫反应中起着关键作用。其中IRAK-4尤其重要，因为它是固有免疫系统中IL-1家族和TLR家族信号通路交汇的关键节点，参与全身炎症反应的调控。IRAK4蛋白涉及类风湿关节炎和化脓性汗腺炎（HS），是目前治疗免疫疾病的深入研究课题。由于IRAK1和IRAK4的ATP结合位点之间的高度相似性，IRAK4的选择性抑制剂或可治疗系统性红斑狼疮。

Compound5、6：Kargbo等认为，PROTAC可以克服IRAK4蛋白的催化结构域高度保守的限制，开发的化合物5、6可有效降解IRAK4，IC₅₀和DC₅₀值低于30 nM。

Compound7、8：Nunes等人使用异喹啉弹头（IRAK4抑制剂）和各种E3配体，如VHL（VonHippel-Lindau）、CRBN或IAP（凋亡抑制剂蛋白）。其中，含有氟基团的化合物7的DC₅₀为259 nM。进一步细化结构，化合物8采用螺旋环嘧啶连接子，比柔性的线性碳链更具刚性和极性，DC₅₀为151 nM。

Compound9：Chen等人研究发现，采用更短长度连接子的PROTACs并没有观察到IRAK4的显著降解，而含有PEG（聚乙二醇）连接子的化合物9可以有效地降低IRAK4的水平。

Compound10：Zhang等人，将环丙基作为连接子偶联位点，化合物10抑制了IL-6的产生；接着改变连接子，合成一系列PROTACs，其中化合物10b和10d的DC₅₀值为190 nM和405 nM。

Compound11、12：Degorce等人在研究IRAK4蛋白时，偶然发现IRAK3抑制剂治疗自免疾病的功效。POI配体采用吡咯三嗪的顺式异构体，E3连接酶配体采用VHL或CRBN。研究表明，含有PEG连接子的CRBN比VHL具有更好的降解能力，且在采用CRBN的情况下，连接子的长度与降解效果成正比。化合物11和12选择性降解IRAK3，DC₅₀分别为0.052 μM和0.002 μM，Dmax分别为74%和98%。

Compound13：Rowley等人也做出了类似的努力，他们研究了IRAK3蛋白来控制树突状细胞介导的IL-12。采用克唑替尼作为POI配体，VHL作为E3连接酶配体，反式环己酰胺作为连接子，化合物13能够有效降解IRAK3，DC50为94 nM和 Dmax为95%。用化合物13处理树突状细胞后，无论LPS（脂多糖）存不存在，IRAK3均被降解，同时在LPS刺激下，IL-12p水平显著升高。

PCAF和GCN5是密切相关的表观遗传蛋白，在多种细胞通路中调节免疫功能。阻断PCAF和GCN5治疗自身免疫性疾病的机制是通过，减少H3K18、H3K9乙酰化， 抑制NF-κB，IFN-β，TBK1过表达，调节炎症免疫信号。

Compound14：Bassi等人采用PCAF和GCN5的活性抑制剂GSK 4027作为POI配体，采用CRBN作为E3连接酶配体，化合物14能够有效降解PCAF和GCN5，DC₅₀分别为1.5 nM，3 nM。在10 min内，浓度为30 nM的化合物14能使蛋白降解80%。 

JAK/STAT通路是一种重要的细胞内信号传导途径，细胞因子与JAK受体结合，启动STAT转磷酸化，导致增殖和分化等活性的基因表达，引发多种疾病，如类风湿性关节炎（RA）、阿尔茨海默病（AD）、炎症性肠病（IBD）和多发性硬化症（MS）。JAK抑制剂，如Tofacitinib、Ruxolitinib、Baricitinib等，通过调节T细胞活化和自然杀伤（NK）细胞活性，改善类风湿性关节炎。

尽管JAK/STAT靶点已经发现了几十年，但其开发仍存在挑战，如药物半衰期短、血栓栓塞等副作用以及JAK/STAT通路和非典型信号转导之间的串扰。PROTACs可能是破局之选。

Compound21-26：Shah等人，以嘧啶和喹恶啉核作为POI配体。其中，喹恶啉基序的细胞渗透性优于嘧啶基序，且对JAK2具有更高的选择性，已证明6个PROTACs具有降解JAK1和JAK2的作用。

Compound28-30：Kargbo等人发现化合物28的EC₅₀为0.0002 μM，进一步设计了含有Ruxolitinib、Baricitinib（强效JAK抑制剂）的化学物29和30，EC₅₀分别为0.00054 μM和0.0039 μM。

RIPK2是一种在细胞内信号传导中起关键作用的激酶，参与调节细胞的固有免疫、适应性免疫以及凋亡过程。RIPK2的过度激活和功能失调可导致多种炎症性疾病、自身免疫疾病、癌症以及神经系统疾病。到目前为止，由于泛抑制作用，还没有可用于临床的RIPK2抑制剂。

Compound32-34：Mares等人开发了化合物32，pDC₅₀（DC₅₀的负对数）为9.4± 0.2，但溶解度较差。进一步，通过添加非亲脂性基团来提高溶解度，合成化合物33，pDC₅₀为7.9。进一步，为了解决大剂量依赖性，所合成的化合物34，效力增加了10倍，pIC₅₀为8.0。

Compound35：Bondeson等人开发的化合物35，DC₅₀为1.4 nM，Dmax为95%。

Compound45-50：Liu等设计了PROTACs来靶向STING途径治疗各种自身免疫疾病，如系统性红斑狼疮。POI配体为C-170 STING抑制剂，E3连接酶配体为为CRBN，合成连接子长度不同的化合物45-50。其中，化合物47显示出最令人满意的结果，DC₅₀值为3.2 μM。在小鼠肾脏组织中的体内研究表明，化合物47可以以剂量依赖的方式降低IFNβ、IL-6和CXCL-10的水平。 

虽然MIF以其抗癌潜力而闻名，但它也与免疫反应有关。

Compound51-56：在Xiao等人开发的，以7-羟基香豆素和7-羟基-3,4-二氢苯并恶嗪-2-1核为POI配体，以CRBN为E3连接酶配体的化合物51-56中，化合物54表现最优，在2 μM时，与MIF的Ki值为71%，MIF在A549细胞中降解率为71%。

IKZF对免疫调节活性至关重要，其基因的多态性可导致系统性红斑狼疮。

图10 靶向IKZF的PROTACs

PROTACs在探索自身免疫性疾病等靶点方面具有良好的体外效力。在理想情况下，研究人员希望获得高Dmax值（例如大于90%的降解效率）和低DC50值，这意味着PROTAC分子在较低浓度下就能实现高效的蛋白降解，预示着更好的治疗效果和更低的副作用。通过优化PROTAC分子的设计，包括选择合适的靶蛋白（POI）配体、E3连接酶配体和连接子（linker），提高了PROTAC分子的疗效和选择性，有望成功将PROTACs带入自免治疗的临床阶段。

参考资料：

https://doi.org/10.1039/D4MD00142G

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