创伤性异位骨化（HO）是一种表现为骨组织在非骨骼组织中的异常形成的病理现象，多见于严重创伤或手术之后，例如骨折愈合、截肢手术或关节置换手术等情形。该病理状态不仅会导致疼痛和肿胀，还会对患者的日常活动能力和生活质量造成显著影响。尽管HO的具体机制尚未完全明了，但普遍认为它与炎症反应的加剧以及骨组织形成的异常密切相关。

 

苦参碱，一种具备抗炎、抗肿瘤及抗病毒等多重药理作用的药物，被广泛应用于治疗炎症和关节疼痛。有研究揭示了苦参碱对巨噬细胞向M2表型极化的影响，其作用机制可能与抗炎活性紧密相关。具体而言，苦参碱可能通过干预特定信号通路，抑制巨噬细胞的M2极化。这一发现为苦参碱在抑制HO方面的应用提供了理论基础。

 

近日，一篇名为“Matrine reduces traumatic heterotopic ossification in mice by inhibiting M2 macrophage polarization through the MAPK pathway”的论文探讨了苦参碱对M2型巨噬细胞通过极化抑制HO能力的影响。

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图1 论文首页

苦参碱抑制BMDM向M2巨噬细胞的极化

 

研究验证了巨噬细胞在小鼠体内HO形成中的作用，并利用CCK-8法来评估苦参碱对巨噬细胞增殖的影响。实验设置了10μM和20μM的浓度梯度。通过免疫荧光（IF）和流式细胞术，确认M2巨噬细胞诱导成功。首先，通过RT-PCR检测，研究发现在20ng/mL IL-4处理后，骨髓源性巨噬细胞（BMDM）中M2巨噬细胞标志物IL-10、TGF-β1、CD206和ARG-1的表达水平显著高于对照组（图2A-D）。然而，当与10μM或20μM苦参碱共同处理后，这些基因的表达水平显著降低（p<0.01）。
接着，研究者使用流式细胞术检测CD206的表达。结果显示，IL-4刺激BMDMs后，CD206的表达显著高于对照组（p<0.001）。但经过20ng/mL苦参碱处理后，这些基因的表达显著降低（p<0.001）（图2E、F）。此外，通过IF实验检测CD206的表达，研究发现IL-4处理后，BMDM中CD206的荧光强度较对照组有所增加。然而，经过20ng/mL苦参碱处理后，荧光强度明显降低（图2G）。这些结果表明，苦参碱能够抑制BMDM向M2表型的极化。

 

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图2 苦参碱抑制巨噬细胞向M2的极化

 

苦参碱抑制BMDMs中的MAPK信号通路

 

该研究利用蛋白印迹法验证了苦参碱对MAPK信号通路的作用。实验中，首先将苦参碱（20μM）作用于BMDMs或不作处理，持续3小时，随后加入IL-4进行刺激。通过蛋白印迹法，分析了p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-P38和P38的蛋白表达水平。结果显示，苦参碱能够抑制p-ERK和p-P38的磷酸化，并呈现出时间依赖性，而对p-JNK的磷酸化无明显影响（图3A）。利用ImageJ软件，研究对p-ERK、p-JNK和p-P38的相对表达量进行了定量分析，并将其分别标准化至总ERK、JNK和P38的水平（图3B-D）。这些数据共同揭示了苦参碱在BMDMs中对MAPK信号通路具有抑制作用。

 

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图3 苦参碱抑制M2巨噬细胞中的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路

 

苦参碱对MC3T3-E1细胞的成骨分化或矿化没有直接影响

在对MC3T3-E1细胞进行成骨诱导后，研究者采用不同浓度的苦参碱对细胞进行了处理。七天后，对细胞进行了碱性磷酸酶（ALP）活性染色，到第二十一天，进行了茜素红（AR）矿化染色（图4A）。定量分析结果显示：苦参碱对MC3T3-E1细胞的成骨分化或矿化过程并没有直接的影响（图4B、C）。
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图4 苦参碱对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响

 

苦参碱抑制小鼠跟腱的异位骨形成

 

研究经八周建模后收集了小鼠的跟腱组织样本。初步的显微CT扫描揭示，在高骨化（HO）组小鼠的跟腱中，骨化组织的形成十分明显。然而，接受不同浓度苦参碱处理的小鼠，骨化现象显著减少（图5A）。统计分析显示，骨化组织的体积存在显著差异（p<0.001）（图5B）。接下来，研究利用免疫组化（IHC）技术检测了CD206和磷酸化ERK（p-ERK）的表达情况（图5C）。

 

在HO组小鼠中，CD206和p-ERK的表达水平显著上升。相比之下，在接受不同浓度苦参碱处理的小鼠中，这两种蛋白的表达水平显著下降（p<0.01）（图5D、E）。最后，研究通过IF技术检测了各组小鼠OCN的表达情况（图5F）。结果显示，HO组小鼠OCN的表达水平明显升高，而在不同浓度苦参碱处理的小鼠中，OCN的表达水平显著降低（p<0.001）（图5G）。综合以上结果，可以得出结论：苦参碱能够有效抑制小鼠的高骨化现象，并且能够降低CD206和p-ERK的表达水平。

 

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图5 苦参碱可减弱小鼠体内HO的形成

 

结论

综上所述，该研究揭示了巨噬细胞与HO之间错综复杂的相互作用。苦参碱通过调节巨噬细胞的极化状态，并抑制MAPK信号通路的关键成分，展现出了作为治疗HO潜在候选药物的潜力。未来的研究应当着重于解析其精确的分子作用机制，评估最佳剂量方案，以及长期的安全性和临床疗效。

 

 

参考文献：
Wang H, Wang X, Zhang Q, Liang Y, Wu H. Matrine reduces traumatic heterotopic ossification in mice by inhibiting M2 macrophage polarization through the MAPK pathway. Biomed Pharmacother. 2024 Aug;177:117130. doi: 10.1016/j.biopha.2024.117130

 

作者｜梅斯医学
编辑 | 竹子