糖尿病肾病（DKD）是糖尿病最具有破坏性的并发症之一，在全球范围内的发病率持续攀升，已成为导致终末期肾病的主要因素。尽管在临床上，控制血压和血糖水平被认为是延缓DKD进展的关键干预手段，但这些措施并不能完全消除糖尿病引发的并发症。因此，寻找有效对抗DKD的药物治疗方案，依然是一个亟待解决的临床挑战。

糖尿病又称“消渴”病症。脾脏负责转化和运输食物中的精微物质，若脾气虚弱，气机失常，将导致食物精微的正常分布受阻，进而产生停滞和积聚，最终引发高血糖现象。黄芪，味甘性微温，主要作用于肺和脾经络，具有补益元气、提升阳气、生津养血、疏通气血阻滞、排解毒邪、促进疮口愈合及生肌等多重功效，因此被广泛应用于糖尿病的治疗。

近日，一篇名为“Astragaloside IV attenuates fatty acid-induced renal tubular injury in diabetic kidney disease by inhibiting fatty acid transport protein-2”探讨了黄芪甲苷IV（AS-IV）对DKD肾小管的保护机制。

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AS-IV可减轻DKD大鼠的蛋白尿和肾小管间质损伤

该研究首先对AS-IV在DKD大鼠模型中的治疗效果进行了评估。结果表明，高脂饮食与链脲佐菌素的联合应用显著提升了大鼠的血糖水平及尿白蛋白/肌酐比值，然而经过8周的AS-IV治疗后，这些指标得到了逆转（图2A、B）。生化分析揭示，与对照组相比，DKD大鼠的血清肌酐水平显著升高，而AS-IV治疗组的血清肌酐水平则呈现出下降趋势（图2C）。cystatin C作为肾小管功能的一个重要指标，经AS-IV治疗后，DKD大鼠尿液中的cystatin C浓度显著降低（图2D）。
为深入评估AS-IV对肾小管间质损伤及纤维化的影响，研究进行了病理染色分析。与对照组相比，PAS和Masson染色显示DKD肾脏存在明显的肾小管损伤和胶原沉积，经过8周的AS-IV治疗，DKD肾脏的病理损伤得到了改善（图2E）。此外，免疫印迹法结果显示，与对照组相比，DKD组e-钙粘蛋白表达降低，而纤维连接蛋白和I型胶原蛋白表达增加。同时，AS-IV治疗显著改善了肾小管损伤，并减弱了纤维化相关标志物的表达（图2F、G）。高剂量AS-IV治疗组大鼠的各项指标改善尤为显著。这些结果表明，AS-IV对DKD大鼠具有显著的肾保护作用。
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图2 AS-IV可减轻DKD大鼠的蛋白尿和肾小管间质损伤

AS-IV可改善了DKD大鼠的脂质代谢和脂肪酸结合白蛋白诱导的肾小管损伤

此外，研究对循环中的脂质谱进行了分析。结果显示，与对照组相比，DKD大鼠的循环中总胆固醇、甘油三酯和游离脂肪酸（FFA）水平显著升高。然而，AS-IV治疗后，这些脂质代谢参数得到了显著改善（图3A-C）。进一步分析显示，与对照组相比，DKD大鼠肾脏中Perilipin-2蛋白和甘油三酯水平升高，AS-IV治疗后降低了DKD大鼠肾脏中DKD-2蛋白和甘油三酯的含量（图3D-F）。为了进一步明确游离脂肪酸结合白蛋白对肾小管细胞的影响，研究对NRK-52E细胞进行了BSA（-）或BSA-PA处理。
免疫印迹分析表明，与对照组相比，单独BSA处理并未诱导肾小管细胞损伤，而BSA-PA处理则降低了E-cadherin蛋白的表达，并提高了纤维连接蛋白和I型胶原蛋白的含量（图3G、H）。这表明，白蛋白本身可能并非肾小管损伤的主要原因，而是与其结合的脂肪酸。为了评估AS-IV对BSA-PA诱导的肾小管损伤的影响，研究首先采用CCK-8法筛选了AS-IV的干预浓度。在20 μM处理24小时或48小时内，均未观察到AS-IV对NRK-52E细胞的毒性。值得注意的是，AS-IV治疗以剂量依赖性地增加了BSA-PA刺激的NRK-52E细胞中E-cadherin蛋白的含量，并降低了纤维连接蛋白和I型胶原蛋白的水平（图3K、L）。

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图3 AS-IV可改善DKD大鼠的脂质代谢和脂肪酸结合白蛋白诱导的肾小管损伤

AS-IV可保护DKD大鼠和BSA-PA处理的NRK-52E细胞的线粒体功能

鉴于线粒体是脂质过氧化攻击的主要靶点，因此研究首先对经BSA（-）或BSA-PA处理的NRK-52E细胞进行了线粒体动力学相关蛋白和特异性抗氧化酶水平的检测。免疫印迹分析表明，BSA（-）的刺激并未对肾小管细胞中Drp1、Mfn1和MN-SOD蛋白的含量产生影响，这表明BSA单独存在时并不对线粒体的形态和功能产生影响。与BSA（-）的刺激相比，BSA-PA以剂量依赖的方式提升了小管细胞中Drp1蛋白的水平，并降低了Mfn1和MN-SOD蛋白的含量（图4A、B）。
同时，AS-IV治疗能够改善BSA-PA刺激细胞的线粒体功能（图4C、D）。此外，研究者使用MitoSOX Red对mtROS进行了检测。结果显示，与BSA（-）相比，暴露于BSA-PA刺激下的NRK-52E细胞表现出更高的荧光密度，而AS-IV显著抑制了mtROS的产生（图4E）。
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图4 AS-IV可保护DKD大鼠和BSA-PA处理的NRK-52E细胞的线粒体功能

AS-IV通过抑制NLRP3炎症级联反应，改善DKD大鼠和BSA-PA处理的NRK-52E细胞的肾小管损伤

mtROS作为与损伤相关的分子模式，在激发先天免疫反应方面扮演着至关重要的角色。该研究进一步明确了NLRP3炎症小体的激活程度。免疫印迹法结果表明，BSA-PA刺激显著激活了NRK-52E细胞中的NLRP3/ASC/Caspase-1炎症级联反应，进而促进了IL-18和IL-1β炎症细胞因子的大量合成。AS-IV通过抑制NLRP3炎症小体，显著减轻了BSA-PA诱导的肾小管细胞的炎症反应（图5A、B）。此外，与对照组相比，DKD大鼠肾脏组织中NLRP3介导的免疫反应显著增强，这一点从NLRP3/ASC/Caspase-1/IL-18/IL-1β炎症级联反应的激活水平升高中得到证实（图5C、D）。
同时，AS-IV连续8周抑制了DKD大鼠中NLRP3、ASC、caspase-1、IL-18和IL-1β蛋白的表达，这反映了AS-IV具有显著的抗炎作用（图5C、D）。为了进一步验证AS-IV是否通过抑制NLRP3炎症小体来改善肾小管损伤，研究采用了NLRP3抑制剂mcc950。Western blot分析显示，mcc950可显著抑制BSA-PA暴露的NRK-52E细胞中IL-18和IL-1β蛋白的表达，其效果优于AS-IV处理（图4E、F）。
值得注意的是，与AS-IV单独治疗相比，AS-IV联合mcc950进一步降低了IL-18和IL-1β炎症细胞因子的表达。肾小管损伤的程度与NLRP3炎症小体的激活程度相一致。在BSA-PA刺激的NRK-52E细胞中，mcc950显著增加了E-钙粘蛋白的表达，降低了纤维连接蛋白和胶原蛋白水平，与单独AS-IV相比，mcc950联合AS-IV具有更强的管状保护作用（图4G、H）。
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图5 AS-IV通过抑制NLRP3炎症级联反应，改善DKD大鼠和BSA-PA处理的NRK-52E细胞的肾小管损伤

结论

该研究确定了AS-IV对肾小管细胞具有保护作用，能够延缓DKD的进展，从而强调了针对肾小管的治疗策略的重要性，同时确定了黄芪甲苷可作为治疗DKD的潜在药物。



参考文献：
Wang J, Wang L, Feng X, Xu Y, Zhou L, Wang C, Wang M. Astragaloside IV attenuates fatty acid-induced renal tubular injury in diabetic kidney disease by inhibiting fatty acid transport protein-2. Phytomedicine. 2024 Aug 27;134:155991. doi: 10.1016/j.phymed.2024.155991


作者｜梅斯医学
编辑 | 竹子
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