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在胃肠(GI)癌症治疗领域，免疫疗法带来了新的希望，但也面临着诸多挑战。最近发表在《Advanced Science》上的研究文章“ANO1-Mediated Inhibition of Cancer Ferroptosis Confers Immunotherapeutic Resistance through Recruiting Cancer-Associated Fibroblasts”揭示了ANO1作为胃肠道肿瘤精确治疗的治疗靶点的潜力。
本研究通过多色免疫荧光技术（mIHC）、转录组测序技术（RNA-seq）、单细胞转录组测序技术(scRNA-seq)等方法，发现ANO1通过激活PI3K-Akt信号通路抑制铁死亡，并通过调节TGF-β信号通路招募癌症相关成纤维细胞（CAFs）进入肿瘤微环境，进而影响CD8+ T细胞介导的抗肿瘤免疫并导致免疫治疗抵抗。
图1：ANO1扩增或高表达预示着不良的免疫治疗结果
研究团队对99名接受免疫疗法的胃肠道癌症患者的基线组织样本进行了回顾性分析，发现ANO1是唯一仅在非响应组发生扩增的基因（图1A）。ANO1基因扩增患者的免疫治疗相关无进展生存期(irPFS)更差，总生存期(irOS)也展现出了更差的趋势（图1B）。基于外部数据库的分析也验证了ANO1基因扩增或高表达的患者预后较差（图1C和1D）。
为了进一步验证上述发现，研究者重新招募了48名胃肠道癌症患者建立前瞻性验证队列，并通过免疫组化确认ANO1的表达状态。研究发现，非响应组患者ANO1阳性率更高（图1E），并且ANO1阴性的患者肿瘤体积变化更良好（图1F、1G、1I），irPFS和irOS也显著好于ANO1阳性组（图1H）。更为重要的是，ANO1阳性患者对免疫治疗产生获得性耐药的比例更高（图1J）。这些结果提示ANO1的扩增或上调与肿瘤免疫治疗不良预后有着密切关系。
图2：ANO1可抑制胃癌的恶性进展
ANO1敲低后，胃癌（GC）和结肠直肠癌（CRC）细胞系的体外增殖率下降，凋亡率升高，迁移和侵袭能力减弱（图2B-2D）。体内CDX模型显示ANO1敲低显著抑制肿瘤生长（图2E&2F）。通过构建腹膜定植模型、局部肝转移模型和远端肺转移模型，证明ANO1敲低能够抑制肿瘤转移（图2G~2I），表明ANO1在促进胃癌生长和转移中起关键作用。
图3：ANO1是胃肠道癌症靶向治疗的可用药靶点
为了进一步探究ANO1作为治疗靶点的潜力，研究者采用了ANO1抑制剂CaCCinh-A01（CAI）和benzbromarone（BBR），发现它们能够有效抑制GC、EC、CRC细胞株及MC38细胞中的ANO1表达（图3A-D），并在ANO1阳性的GC和GIST PDX模型中表现出显著的抗肿瘤作用（图3E-G），支持ANO1作为胃肠道癌症的潜在治疗靶点。
图4：ANO1有助于一个免疫抑制的肿瘤微环境
ANO1敲减降低了肿瘤的生长速度（图4B），并增加了CD8+/granzyme B阳性细胞的浸润，同时降低了PD-L1的表达（图4C, D）。ELISA检测也发现IFN-γ、granzyme B、TNF-α和IL-13的表达显著升高，而免疫抑制细胞因子IL-4在ANO1敲减后几乎保持不变（图4E）。此外，多重免疫组化（mIHC）显示ANO1阳性组的CD8+ T细胞浸润明显少于ANO1阴性组（图4G）。这些结果表明ANO1有助于形成免疫抑制的肿瘤微环境，而ANO1敲除可以恢复免疫活性。
图5：抑制ANO1可以增强抗pd-1免疫治疗对胃肠道癌症的有效性
基于ANO1的免疫抑制作用，研究者进一步评估了ANO1抑制联合PD-1抗体的治疗效果。ANO1敲除或使用ANO1抑制剂CAI/BBR均能显著增强抗PD-1抗体对MC38和CT26异种移植瘤的抗肿瘤作用（图5A-D）。通过长期、低剂量的抗PD-1抗体诱导，建立了对免疫治疗获得性耐药的模型（图5E）。与祖细胞相比，获得性耐药的细胞中ANO1的表达水平升高（图5F），ANO1抑制剂CAI也能提高获得性耐药细胞对抗PD-1抗体的敏感性（图5G）。
图6：ANO1通过抑制铁死亡促进癌症进展，损害免疫治疗效果
RNA测序显示ANO1敲除后铁死亡通路显著富集（图6A），ANO1与铁死亡抑制因子NRF2/SLC7A11正相关（图6B）。研究者在细胞水平验证了ANO1对NRF2和SLC7A11表达以及肿瘤细胞铁死亡的调控作用（图6C-H）。通过对ANO1敲减后细胞测序结果的分析，研究人员发现PI3K-Akt途径的富集（图7），并在细胞中验证了PI3K-Akt途径参与ANO1对肿瘤细胞铁死亡的调控作用。
图7：ANO1通过激活PI3K-Akt信号通路减弱铁死亡
图8：ANO1介导的铁死亡抑制可刺激TGF-β的释放，并招募与癌症相关的成纤维细胞进入免疫微环境，产生对免疫治疗的耐药性
最后，研究人员探究了ANO1与肿瘤相关成纤维细胞（CAF）的关系。ANO1表达与CAF浸润正相关（图8A&8B）。通过多重免疫组化染色（mIHC）发现ANO1敲除减少了CAF的浸润并增强了CD8+ T细胞的浸润（图8C），降低了CAF分布的肿瘤/基质比，同时增加了CD8+ T细胞分布的肿瘤/基质比（图8D）。机制上，ANO1可能通过促进TGF-β等的表达和分泌促进CAF浸润（图8E、F）。这些证据进一步表明ANO1通过PI3K-Akt-铁死亡通路促进CAF浸润构建免疫抑制微环境，造成免疫治疗疗效不佳。
本研究中使用了多种检测技术去评估ANO1在胃癌治疗中的作用：
多色免疫荧光技术（mIHC）
● 定位和定量特定细胞类型：mIHC允许同时检测和量化组织切片中的多种蛋白质标志物，这对于理解不同细胞类型（如CAF和CD8+ T细胞）在肿瘤微环境中的分布至关重要。
● 空间关系分析：通过mIHC，研究人员能够分析细胞之间以及细胞与肿瘤组织结构之间的空间关系，这对于理解ANO1敲除如何改变CAF和CD8+ T细胞的分布非常有用。
● 癌症研究：mIHC可用于研究不同类型癌症中的免疫细胞分布和相互作用。
● 疾病诊断：通过检测特定的生物标志物，mIHC可以帮助医生更准确地诊断疾病。
● 药物开发：mIHC可以用来评估新药物对肿瘤微环境的影响，包括免疫细胞的变化。
转录组测序技术（RNA-seq）
● 基因表达分析：RNA-seq允许研究人员全面了解ANO1敲除前后细胞内的基因表达模式，这对于确定ANO1在调控铁死亡和PI3K-Akt信号通路中的作用非常重要。
● 信号通路富集分析：通过对差异表达基因进行功能注释和通路分析，可以揭示ANO1在细胞生物学过程中的作用。
● 疾病机制研究：RNA-seq可用于探索各种疾病的分子机制，包括癌症、自身免疫性疾病和神经退行性疾病。
● 个性化医疗：通过分析患者的转录组数据，可以为个体提供定制化的治疗方案。
● 药物靶点识别：RNA-seq可以帮助科学家发现新的药物靶点，促进新药的开发。
单细胞转录组测序技术（scRNA-seq）
● 细胞异质性分析：scRNA-seq可以揭示肿瘤微环境中不同细胞亚群的基因表达模式，这对于理解免疫治疗耐药机制至关重要。
● 免疫细胞鉴定：通过scRNA-seq，研究人员可以识别和表征不同类型的免疫细胞，例如CAF和CD8+ T细胞。
● 发育生物学：scRNA-seq可以用于研究细胞分化过程中基因表达的变化。
● 免疫学研究：通过分析免疫细胞的转录组，scRNA-seq可以帮助研究人员更好地理解免疫系统如何应对感染和疾病。
● 癌症进化研究：scRNA-seq可以揭示肿瘤内部的克隆异质性，有助于追踪癌症的进化过程。
这项研究强调了ANO1在GI癌症免疫治疗中的重要性，为开发新的治疗策略提供了理论依据。ANO1作为潜在的治疗靶点，可能有助于克服免疫治疗的抵抗问题，提高患者的生存率。然而，ANO1作为治疗靶点的有效性和安全性仍需进一步验证，尤其是在人体临床试验中。随着更多研究的开展，我们期待在未来能够看到ANO1在临床实践中发挥重要作用。
注：本文旨在介绍医学研究进展，不做治疗方案推荐。如有需要，请咨询专业临床医生。
参考文献：
Jiang F, Jia K, Chen Y, Ji C, Chong X, Li Z, Zhao F, Bai Y, Ge S, Gao J, Zhang X, Li J, Shen L, Zhang C. ANO1-Mediated Inhibition of Cancer Ferroptosis Confers Immunotherapeutic Resistance through Recruiting Cancer-Associated Fibroblasts. Adv Sci (Weinh). 2023 Aug;10(24):e2300881.
