近年来，糖尿病患者数量逐年递增，国际糖尿病联合会预测数据表明，到2045年，全球糖尿病患者人数将超7亿。而糖尿病肾病（DN）作为糖尿病患者最主要的并发症之一，在我国发病率亦呈逐年上升的趋势。DN以蛋白尿和肾功能受损为特征，是导致终末期肾病的重要原因。现代医学表明，线粒体损伤可能是DN发生发展的关键因素。

 

金蝉益肾通络方（JCYSTL）是中医常用的治疗DN的方剂，由蝉花、黄芪、玄参、莪术、僵蚕、水蛭、鬼箭羽、川牛膝等中药组成，具有益肾通络之功效。但对于全方在治疗DN方面的具体机制尚不清楚。不过有研究表明方中一些中药如黄芪和水蛭，可调节HIF-1α、自噬和线粒体功能，这提示JCYSTL治疗DN可能与影响细胞线粒体功能相关。

近日，一篇标题为“JinChan YiShen TongLuo Formula ameliorate mitochondrial dysfunction and apoptosis in diabetic nephropathy through the HIF-1α-PINK1-Parkin pathway”的学术论文，从调控线粒体功能的角度出发，深入探究了JCYSTL对改善DN方面的潜在作用机制。

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图1 论文首页

JCYSTL改善大鼠肾脏形态与功能

研究采用单侧肾切除术联合低剂量链脲佐菌素腹腔注射构建DN大鼠模型，随机分为正常对照组、模型组、JCYSTL组和FG-4592组，正常对照组给予假手术和生理盐水灌胃，持续12周后处死大鼠。结果显示，JCYSTL治疗可显著减少肾小管损伤与炎症细胞浸润（图2A），此外，还降低DN大鼠的蛋白尿、血清肌酸酐、血尿素氮和尿酸水平，并增加肌酸酐清除水平（图2B-I）。

 

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图2 JCYSTL和FG-4592对DN大鼠肾脏形态及功能的影响

 

JCYSTL改善HG/缺氧诱导的HK-2细胞线粒体功能障碍，抑制细胞凋亡

研究采用Sprague-Dawley大鼠灌胃JCYSTL制备给药血清，并通过高糖（HG）和缺氧诱导HK-2细胞构建体外模型。实验可知，JCYSTL含药血清可增加线粒体膜电位（图3A-B），改善线粒体呼吸链复合体I、III和IV的活性（图3C-E），这提示JCYSTL对HK-2细胞的保护作用可能通过改善线粒体功能障碍来实现。

此外，有文献表明线粒体功能障碍可诱导细胞凋亡，研究者通过Annexin V-FITC/PI双染法发现JCYSTL含药血清可降低凋亡细胞百分比和凋亡蛋白Bax的表达，增加HK-2细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达（图3F-K），这提示JCYSTL可以抑制HG/缺氧诱导的HK-2细胞的凋亡。

 

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图3 JCYSTL含药血清对HG/缺氧诱导的HK-2细胞线粒体功能障碍和细胞凋亡的影响

JCYSTL 激活 HG/缺氧诱导的 HK-2 细胞中的 PINK1 介导的线粒体自噬

PINK1-Parkin介导的线粒体自噬往往被认为是消除受损线粒体的机制，研究进一步评估了JCYSTL对HG/缺氧诱导的HK -2细胞线粒体自噬的影响发现，在HG/缺氧诱导的HK -2细胞中PINK1、Parkin和LC3-II的水平显著降低，P62水平升高（图4A-I），而JCYSTL的处理则增加了细胞中PINK1和Parkin的积累。

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图4 JCYSTL含药血清对HG/缺氧诱导的HK-2细胞线粒体自噬的影响

为明确PINK1介导的自噬通路是否是JCYSTL治疗DN的关键信号通路，研究者利用RNA干扰技术对PINK1进行了敲低，发现当PINK1敲低时，JCYSTL将不能改善HG/缺氧诱导的HK-2细胞中Parkin、LC3-II和P62的变化（图5C-F）。这提示PINK1介导的自噬通路可能是JCYSTL发挥作用的关键信号通路。

 

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图5 JCYSTL含药血清对HG/缺氧诱导的HK-2细胞线粒体自噬的影响

PINK1敲低后逆转JCYSTL改善线粒体功能障碍和细胞凋亡的作用

此外，当PINK1敲低时，JCYSTL对Bax的抑制作用及其对MMP和Bcl-2的促进作用消失（图6）。

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图6 JCYSTL对PINK1基因敲低后HK-2细胞线粒体功能障碍和凋亡的影响

JCYSTL对DN大鼠HIF-1α表达的影响

HIF-1α是缺氧应答的关键细胞因子，在DN的发生发展中起到重要作用。为明确HIF-1α信号通路是否参与JCYSTL对DN的治疗作用，研究者将FG-4592作为阳性对照药，免疫组化结果显示JCYSTL治疗组在体内显示出明显高于模型组的HIF-1α表达，且与FG-4592在DN大鼠中的作用相当（图7A-C）。

 

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图7 JCYSTL对DN大鼠HIF-1α表达的影响

JCYSTL通过HIF-1α调节PINK/parkin介导的线粒体自噬

研究者通过线粒体外膜蛋白VDAC与自噬体标记物LC3-Ⅱ共定位观察线粒体自噬的过程发现，当HIF-1α表达上调时，共定位增加（图8D-F），这提示JCYSTL可能通过HIF-1α调节PINK/parkin介导的线粒体自噬。

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图8 JCYSTL通过HIF-1α调控PINK/parkin介导的线粒体自噬

使用转染了PINK1-RNAi的HK-2细胞进行实验发现PINK1的敲低并不影响JCYSTL处理的HG/缺氧HK-2细胞中的HIF-1α积累（图9），这提示HIF-1α是PINK1介导的线粒体自噬的上游调节因子。

 

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图9 敲除PINK1对HK-2细胞中HIF-1α表达的影响

HIF-1α上调改善DN大鼠线粒体功能障碍和细胞凋亡

采用电镜观察线粒体发现JCYSTL和FG-4592都改善了DN大鼠肾小管中的线粒体形态异常（图10A），而WB实验和IHC染色可见JCYSTL或FG-4592给药阻断了DN大鼠的线粒体凋亡信号（图10E-H）。

 

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图10 HIF-1α的上调可改善DN大鼠的线粒体功能障碍和细胞凋亡

 

结论

JCYSTL对DN的治疗作用是通过调控HIF-1α-PINK1-Parkin信号通路影响线粒体功能障碍和细胞凋亡实现的。

参考文献：
Qiyan zheng, Xueqin Zhang, Jing Guo, et al.JinChan YiShen TongLuo Formula ameliorate mitochondrial dysfunction and apoptosis in diabetic nephropathy through the HIF-1-PINK1-Parkin pathway,Journal of Ethnopharmacology,Volume 328,2024,117863,ISSN 0378-8741

 

作者｜梅斯医学
编辑 | 竹子